Tampilan:0 Penulis:Editor Situs Publikasikan Waktu: 2021-11-24 Asal:Situs
Jika PCR kuantitatif fluoresensi real-time untuk kuantifikasi virus dan genotipe SNP, kita memerlukan mesin PCR dengan spesifisitas setinggi mungkin;jika itu adalah deteksi patogen dan mRNA, diperlukan sensitivitas yang tinggi mesin PCR, lalu bagaimana cara mengoptimalkan mesin PCR ini?
Berikut daftar isinya:
l Meningkatkan efisiensi amplifikasi mesin PCR
l Menggunakan primer mesin PCR real-time untuk PCR umum
Meningkatkan mesin PCR efisiensi amplifikasi, spesifisitas, dan sensitivitas, kami dapat mengoptimalkan mesin PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata untuk eksperimen melalui serangkaian tindakan.Yang pertama adalah pemilihan urutan target.
1, pilihan urutan target mesin PCR real-time yang nyaman dengan panjang yang sesuai antara 50 hingga 150bp.Urutan yang lebih pendek membutuhkan lebih sedikit waktu untuk disintesis dan memiliki waktu amplifikasi yang lebih pendek, sehingga kemungkinan kontaminasi DNA yang diamplifikasi berkurang.
2, Saat memilih urutan target, gunakan pencarian BLAST untuk menganalisis urutan target untuk polimorfisme dan kesalahan urutan serta menghindarinya.Jika terdapat duplikasi sequence pada sequence target maka akan menurunkan sensitivitas pendeteksian mesin PCR ini dan juga harus dihindari.
3, kontrol konten GC ≤ 60% dalam urutan target.Kandungan GC yang tinggi, akan mempengaruhi denaturasi urutan target dalam siklus termal, namun juga mudah untuk menghasilkan amplifikasi non-spesifik mesin PCR ini.
4, hindari menghasilkan struktur sekunder.Urutan target dengan urutan berulang terbalik mudah untuk menghasilkan struktur sekunder, yang mempengaruhi hibridisasi primer dan probe mesin PCR real-time yang nyaman.
Selain itu, kita juga perlu memastikan bahwa kualitas templat tidak akan mempengaruhi amplifikasi, dan hasil mesin PCR real-time yang nyaman dapat diandalkan.Misalnya, DNA yang rusak tidak dapat diamplifikasi secara memadai di mesin PCR, atau tidak diamplifikasi sama sekali.Selain itu, keberadaan reagen penghambat DNA polimerase (DMSO, dll.) dan kontaminan (SDS, dll.) pada templat dapat mempengaruhi keandalan hasil amplifikasi mesin PCR.
Dapatkan kenyamanan secara real-time mesin PCR primer, cara ini juga bisa digunakan untuk PCR biasa.
1, Panjangnya harus 18-30bp untuk memastikan kekhususan pengikatan.
2, Suhu leleh (nilai Tm) harus 55-60°C, dan nilai Tm kedua primer harus berbeda 2-3°C.
3, Setiap primer harus memiliki 1 hingga 3 guanin atau sitosin di ujung 3', yang dapat dengan mudah mengurangi amplifikasi non-spesifik selama mesin PCR secara real-time.Lebih dari 3 akan menjadi bumerang dan menimbulkan 'efek geser' yang menyebabkan ekstensi salah.
4. Kandungan GC pada primer sebaiknya sekitar 50%, kandungan GC yang terlalu tinggi akan meningkatkan nilai Tm.
5, primer mesin PCR harus menghindari urutan berulang yang terbalik, karena akan membentuk struktur sekunder, yang mempengaruhi pengikatan primer pada templat.
6, Jika itu adalah RT-PCR, Anda juga harus menghindari merancang primer untuk mengikat urutan ekson, yang akan menghasilkan hasil eksperimen mesin PCR positif palsu.Pendekatan yang benar harus dirancang pada sisi intron panjang, atau intron pendek, atau melintasi wilayah persimpangan ekson-ekson.
7. Menghilangkan garam dan memurnikan primer.
Perhatikan bahwa terkadang, setelah Anda melakukan semua poin, primer mungkin tidak menguat, jadi Anda harus mendesain ulang primer tersebut.
Berfokus pada deteksi cepat asam nukleat dan deteksi cepat POCT, Bioteke menawarkan berbagai instrumen laboratorium seperti: pengumpulan sampel virus, ekstraktor asam nukleat otomatis, mesin PCR, dan peralatan desinfektan.Dan juga menyediakan berbagai macam reagen & kit.
